Me lo mandó como documento word y lo metí en el wiki
Trabajo elaborado, no escrito en formato publicación , y sin bibliografía citada. Aparecen unas referencias al final. Porqué busca peptidos lider de una proteína que no va a ser secretada? Porqué hace alineamientos y arboles con Homo, Drosophila.....? Qué pasa cuando deleciona el gen o cuando lo muta? La proteina empieza en VIDLK.. y no en ARRQ. y ESTUDIO DE LA PROTEÍNA SERIL T-RNA SINTETASA EN Rhodococcus
Vanessa Nicolás García
Departamento Biología Molecular
Facultad Ciencias ambientales y Biológicas
León
RESUMEN
Se ha realizado un estudio con un microorganismo del género Rhodococcus.
Hemos elegido una de sus proteínas para analizar sus características y la del gen que la codifica.
La proteína en cuestión es la seril t-RNA sintetasa.
Para ello hemos hecho varios estudios bioinformáticas sobre las propiedades de la proteína conociendo así un poco más su función, localización y características fisico-químicas entre otras.
Estudiando el gen hemos diseñado primers para hacer distintas mutaciones, amplificaciones, fusión de proteínas y adicción de colas de histidina para poder ver como afectan estas alteraciones a la funcionalidad de la proteína y también poder determinar su localización celular.
INTRODUCCION
El género Rhodococcus pertenece a un grupo de microorganismos incluidos en el grupo de los actinomicetos nocardioformes, dentro de ellos en las bacterias que poseen ácidos micólicos en la pared celular. A este grupo pertenecen también los géneros Gordona, Nocardia y Tsukamurella.
Dentro del género Rhodococcus encontramos descrita nueve especies.
Es un género ampliamente distribuido por el medio ambiente. Entre otras localizaciones lo encontramos como patógeno del hombre y animales, actuando como microorganismos oportunistas causando infecciones.
Son bacterias Gram positivas de forma bacilar y cocoidal, parcialmente alcohol-ácido resistentes y aeróbicas. Crecen bien a temperaturas de 30-37ºC. Son sensibles a lisozima.
Trabajamos con una secuencia de 17.000 nucleótidos, en la cual buscamos los ORF que codifican para proteínas mediante el programa ARTEMIS y de todas ellas elegimos una(figura 1).
La proteína estudiada es la enzima seril t-RNA sintetasa., su función es la adicción de serina en la síntesis de proteínas.
Pertenece al grupo de las aminoacil t-RNA sintetasas, estas enzimas aceptan el aminoácido activado apropiado (en este caso la serina), interactúa con con el RNA mensajero y los ribosomas de tal forma que asegura que el aminoácido que transporta sea colocado correctamente en la secuencia de la cadena polipeptídica en crecimiento.
Los aminoácidos son activados por la aminoacil t-RNA sintetasas por la reacción:
ATP + aminoácido1 + E1 ↔ aminoácido1-AMP-E1 + PPi
A continuación el t-RNA específico para ese aminoácido debe aceptar el aminoácido activado según la reacción:
Las aminoacil t-RNA sintetasas deben de poseer al menos dos lugares de enlace, el primer lugar reconoce un aminoácido determinado y el segundo selecciona la molécula de t-RNA específico a la que el aminoácido debe unirse covalentemente.
Hemos hecho un estudio con el gen de la seril t-RNA sintetasa y con la proteína:
1. Análisis del gen de la seril t-RNA sintetasa:
a) Diseño de primers para la amplificación del gen por PCR.
b) Diseño de primers para amplificar un fragmento interno del gen.
2. Análisis de la proteína seril t_RNA sintetasa:
a) Diseño de primers para amplificar el gen de la proteína con colas de histidina para su rápida purificación.
b) Diseño de primers para la delección de un fragmento del gen de la proteína.
c) Diseño de primers para la mutación de un nucleótido.
d) Diseño de primers para realizar la fusión génica entre la seril t-RNA sintetasa y la proteína fluorescente verde para estudiar su localización celular o su concentración a lo largo del crecimiento del microorganismo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tenemos que realizar distintas PCR para analizar el gen, para ello usamos el plásmido pOJ260 de E.coli (figura 2), en el cual clonaremos el gen de la seril t-RNA sintetasa.
Este plásmido es un plásmido suicida, es decir, no replica en E.coli porque lleva el origen de replicación de otra cepa pero sí puede integrarse en el cromosoma de E. coli por recombinación.
Para poder clonar el DNA del gen en el plásmido tenemos que poner sitios de corte para algún enzima de restricción en los extremos 5´ de los primers, estos sitios de corte tienen que ser para enzimas de restricción que se encuentren dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido.
El plásmido lo introduciremos en células de E.coli para obtener los productos génicos de nuestro gen.
TÉCNICA PCR:
Es la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
Esta técnica es usada para la amplificación de un fragmento de DNA.
Para ello necesitamos buffer de amplificación, primers, desoxinucleótidos trifosfato, Taq polimerasa, DNA molde y adyuvantes.
La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos, cada uno de los cuales incluye tres pasos:
Desnaturalización: necesitamos tener el DNA molde en forma de cadena sencilla, para ello le sometemos a temperaturas de 90-95ºC para romper los puentes de hidrógeno que rompen ambas cadenas. Le mantenemos a esta temperatura durante unos minutos para que desnaturalice completamente.
Anillamiento: disminuimos la temperatura hasta 40-60ºC para que se puedan unir los primers al fragmento de DNA que queremos amplificar. La temperatura óptima de hibridación (Tm) es distinta para cada primer, pero debe ser similar para los primers usados en cada reacción.
Extensión: se realiza a una temperatura de unos 70ºC. Se incorporan deoxinucleótidos en el extremo 3´ del primer usando como molde el fragmento de DNA que queremos amplificar.
Todo este proceso se realiza en un termociclador al cual le añadimos la mezcla de reacción y el DNA a amplificar.
Usamos dos primers para realizar la amplificación, directo (complementario al extremo 3´ de la cadena codificante) y reverso (complementario al extremo 3´ de la cadena complementaria).
En el extremo 5´ de los primers debemos añadir la secuencia de corte para un enzima de restricción que se encuentre en el polilinker del plásmido para poder clonar este gen en el plásmido.
ESTUDIO DEL GEN Y LA PROTEÍNA:
Análisis del gen de la seril t-RNA sintetasa:
a) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN POR PCR:
Para ello realizamos una técnica de PCR en la cual utilizaremos dos primers flanqueantes al gen , directo y reverso.
En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima BamHI. (ANEXO I).
b) DISEÑO DE PRIMERS PARA AMPLIFICAR UN FRAGMENTO INTERNO DEL GEN:
Para realizar esta amplificación por PCR necesitamos diseñar primers internos al gen, para ello usamos el programa PRIMER 3, el cual nos da varios pares de primers con la probabilidad de cada uno de que sea el correcto, entre ellos elegimos una pareja.
En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima XbaI. (ANEXO II).
Análisis de la proteína seril t-RNA sintetasa:
a) DISEÑO DE PRIMERS PARA AMPLIFICAR EL GEN DE LA PROTEÍNA CON COLAS DE HISTIDINA PARA SU RÁPIDA PURIFICACIÓN:
Para ello hacemos una PCR utilizando dos primers flanqueantes al gen , directo y reverso.
En el extremo 5´ del primer reverso añadimos 10-12 tripletes para el aminoácido histidina (codón histidina para Rhodococcus TAC)y a continuación el sitio de corte para el enzima de restricción.
En el extremo 5´ del primer directo añadimos la secuencia de corte el enzima de restricción.
En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima BamHI.
Una vez amplificada la proteína la purificamos en una columna de afinidad de Níquel que es muy específica para los residuos de histidina. Al pasar la preparación con la proteína unida a las colas de histidina quedará fuertemente unida a la columna. Posteriormente eluimos la proteína con imidazol para separarla de la columna, obtenemos la proteína unida a la cola de histidinas, a continuación añadimos una enzima (ej: enterocinasa) para eliminar la cola de histidina y así obtener la proteína pura.
(ANEXO III)
b) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA DELECCIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE LA PROTEÍNA:
Deleccionamos un fragmento interno del gen.
Para ello hacemos una PCR usando cuatro primers, dos de ellos externos, igual a los usados en la amplificación del gen, y dos internos. Los internos deben flanquear al fragmento de DNA que queremos deleccionar.
La secuencia de corte para el enzima de restricción debemos añadirla en los extremos 5´ de los primers externos, en este caso usamos la enzima SacII.
(ANEXO IV).
c) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA MUTACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO:
Realizamos la mutación de un nucleótido interno del gen.
Para ello debemos hacer una PCR usando cuatro primers, dos de ellos externos y dos internos.
Los primers externos se diseñan igual que para realizar la amplificación del gen. Los internos son complementarios entre sí, deben de llevar la misma secuencia que el gen y un nucleótido, el que queremos mutar, cambiado por el nuevo que queremos introducir.
Al cambiar el nucleótido podemos cambiar el aminoácido para el que codifica, en este caso cambiamos el aminoácido glicina por valina, para ello mutamos el triplete GGC a GTC.
El nucleótido que queremos mutar debe estar aproximadamente en el centro del primer.
La secuencia de corte para el enzima de restricción debemos añadirla en los extremos 5´ de los primers externos, en este caso usamos la enzima BamHI. (ANEXO V).
d) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA FUSIÓN GÉNICA ENTRE LA SERIL T-RNA SINTETASA Y LA PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE:
Fusionamos el extremos carboxilo de nuestra proteína (Seril t-RNA sintetasa) al extremo amino de la proteína fluorescente verde (GFP).
Para realizar la fusión hacemos una PCR usando también cuatro primers, dos para cada proteína.
El primer 1 debe ser complementario al extremo 3´ de la cadena codificante de la seril t-RNA sintetasa.
El primer 2 debe contener el extremo 5´ de la cadena codificante de la seril t-RNA sintetasa sin el últimos codón (codón STOP) y el extremo 3´ de la cadena codificante de la GFP.
El primer 3 debe contener el extremo 3´ de la cadena complementaria de la seril t-RNA sintetasa eliminando el codón STOP y el extremo 5´ de la cadena complementaria de la GFP.
El primer 4 debe contener el extremo 5´ de la cadena codificante de la GFP.
Los sitios de corte para el enzima de restricción debemos añadirlos en los extremos 5´ de los primers 1 y 4, en este caso usamos la enzima EcoRI.
(ANEXO VI).
PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP):
La GFP se usa para fusionarla con la proteína que queremos estudiar y mediante la emisión de fluorescencia de la GFP poder localizar nuestra proteína.
Esta proteína GFP fue aislada de la medusa Aequorea victoria. Emite luz verde cuando se la ilumina con luz UV gracias al cromóforo que posee que es una estructura de tripéptido cíclico en la secuencia primaria de la proteína, los 3 aminoácidos que forman el cromóforo son Ser65-Tyr66-Gly67. Es una proteína estable que contiene 238 aminoácidos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Esta enzima es un homodímero funcional con un dominio C-terminal característico de la clase II de las aminoacil t-RNA sintetasas y un dominio N-terminal implicado en la unión de los t-RNA (tabla 1).
Pertenece a las llamadas proteínas coiled-coil (gráfico 1), esto es, que tienen dominios para unirse unas proteínas a otras polimerizándose. Esta característica es importante para la estabilidad de la enzima.
Las características fisico-químicas se muestran en la tabla (tabla 2).
Muestra diversos sitios de corte para distintas proteasas, en la tabla se muestran las proteasas que cortan, el número de cortes para cada una de ellas y el sitio específico de corte(tabla 3).
La proteína no presenta péptido líder (gráfico 2), lo cual nos indica que es una proteína citoplasmática, ya que el péptido líder en una proteína es una secuencia de aminoácidos presente en su extremo amino que sirve de señal para excretar la proteína al exterior de la célula.
Es una proteína citosólica, ya que según se muestra en la gráfica (gráfico 3) vemos que la probabilidad de poseer dominios transmembrana es menor que la probabilidad de que esté fuera de la membrana.
Los aminoácidos conservados que presenta la seril t-RNA de Rhodococcus respecto a otros organismos los vemos en la tabla 4.
El árbol filogenético de Rhodococcus se muestra en el gráfico 4.
En cuanto a los resultados obtenidos mediante las PCR:
Tras la delección del fragmento interno del gen vemos que la proteína no es funcional, las proteínas sintetizadas a partir de la seril t-RNA sintetasa deleccionada no se traducen correctamente debido a que no incluyen el aminoácido serina, debido a esto, las bacterias que contienen la enzima deleccionada mueren.
Por el contrario cuando sólo mutamos un aminoácido de la enzima las bacterias sobreviven, la enzima mantiene su funcionalidad aunque su estructura tridimensional es ligeramente distinta a la de la enzima silvestre.
Con el experimento de fusión con la GFP podemos ver la localización de nuestra enzima iluminando las bacterias con luz UV, en este caso vemos una distribución más o menos homogénea de la proteína a través del citoplasma.
El gen posee sitios de corte para varias enzimas de restricción que se muestran en el gráfico 5.
TABLAS Y GRÁFICOS
figura 1
figura 2
Significant Pfam-A MatchesShow or hide all alignments.
<span style="font-size: 8pt;"> I P P V L V R P E V M Q G T <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">G</span> F L G Q H S D E V Y H L A D D D L Y L F1 </span>
<span style="font-size: 8pt;"> S R R C W C A P R S C R A P A S S A S T R T R S T T W P T T T C T F2 </span>
<span style="font-size: 8pt;"> P A G A G A P R G H A G H R L P R P A L G R G L P P G R R R P V P F3 </span>
Tzukamura M. A further numerical taxonomic study of the rhodochrous group. Jap J Microbiol 1974; 18: 37-44.
Goodfelow M, BeckhamAR, Barton MD. Numerical classification of Rhodococcus equi and related actinomycetes. J Appl Bacteriol 1982; 53: 199-207.
Conti-Díaz IA, Calegari L, Civila E. Revisión de los casos nacionales de infecciones por actinomicetos del género Nocardia. Rev Urug Patol Clin Microbiol 1974; 12: 25-33
Osoagbaka OU. Evidence for the pathogenic role of Rhodococcus species in pulmonary diseases. J Appl Bacteriol 1989; 66: 497-506.
Goodfelow M, Anderson G, Chun Jongsik. Rhodococcal systematics: problems and developments. Antonie Van Leeuwenhoek 1998; 74: 3-20.
Serrano JA, Tablante RV, de Serrano AA, de San Blas GC, Imaeda T. Physiological, chemical and ultrastructural characteristics of Corynebacterium rubrum. J Gen Microbiol 1972; 70: 339-49.
Russell, David and Sambrook, Joseph. Molecular cloning a laboratory manual. CSHL PRESS Edit. 3ª edición. Volumen I, II, III.
Knudsen, S., P. Saadbye, L.H. Hansen, A. Collier, B.L. Jacobsen, J. Schlundt, and O.H.
Karlstrom. 1995. Development and testing of improved suicide functions for biological containment of bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 61:985.991
Me lo mandó como documento word y lo metí en el wiki
Trabajo elaborado, no escrito en formato publicación , y sin bibliografía citada. Aparecen unas referencias al final. Porqué busca peptidos lider de una proteína que no va a ser secretada? Porqué hace alineamientos y arboles con Homo, Drosophila.....? Qué pasa cuando deleciona el gen o cuando lo muta? La proteina empieza en VIDLK.. y no en ARRQ. y
ESTUDIO DE LA PROTEÍNA SERIL T-RNA
SINTETASA EN Rhodococcus
Vanessa Nicolás García
Departamento Biología Molecular
Facultad Ciencias ambientales y Biológicas
León
RESUMEN
Se ha realizado un estudio con un microorganismo del género Rhodococcus.
Hemos elegido una de sus proteínas para analizar sus características y la del gen que la codifica.
La proteína en cuestión es la seril t-RNA sintetasa.
Para ello hemos hecho varios estudios bioinformáticas sobre las propiedades de la proteína conociendo así un poco más su función, localización y características fisico-químicas entre otras.
Estudiando el gen hemos diseñado primers para hacer distintas mutaciones, amplificaciones, fusión de proteínas y adicción de colas de histidina para poder ver como afectan estas alteraciones a la funcionalidad de la proteína y también poder determinar su localización celular.
INTRODUCCION
El género Rhodococcus pertenece a un grupo de microorganismos incluidos en el grupo de los actinomicetos nocardioformes, dentro de ellos en las bacterias que poseen ácidos micólicos en la pared celular. A este grupo pertenecen también los géneros Gordona, Nocardia y Tsukamurella.
Dentro del género Rhodococcus encontramos descrita nueve especies.
Es un género ampliamente distribuido por el medio ambiente. Entre otras localizaciones lo encontramos como patógeno del hombre y animales, actuando como microorganismos oportunistas causando infecciones.
Son bacterias Gram positivas de forma bacilar y cocoidal, parcialmente alcohol-ácido resistentes y aeróbicas. Crecen bien a temperaturas de 30-37ºC. Son sensibles a lisozima.
Trabajamos con una secuencia de 17.000 nucleótidos, en la cual buscamos los ORF que codifican para proteínas mediante el programa ARTEMIS y de todas ellas elegimos una(figura 1).
La proteína estudiada es la enzima seril t-RNA sintetasa., su función es la adicción de serina en la síntesis de proteínas.
Pertenece al grupo de las aminoacil t-RNA sintetasas, estas enzimas aceptan el aminoácido activado apropiado (en este caso la serina), interactúa con con el RNA mensajero y los ribosomas de tal forma que asegura que el aminoácido que transporta sea colocado correctamente en la secuencia de la cadena polipeptídica en crecimiento.
Los aminoácidos son activados por la aminoacil t-RNA sintetasas por la reacción:
ATP + aminoácido1 + E1 ↔ aminoácido1-AMP-E1 + PPi
A continuación el t-RNA específico para ese aminoácido debe aceptar el aminoácido activado según la reacción:
aminoácido1-AMP-E1 + t-RNA1 ↔ t-RNA1-aminoácido1 + AMP + E1
Las aminoacil t-RNA sintetasas deben de poseer al menos dos lugares de enlace, el primer lugar reconoce un aminoácido determinado y el segundo selecciona la molécula de t-RNA específico a la que el aminoácido debe unirse covalentemente.
Hemos hecho un estudio con el gen de la seril t-RNA sintetasa y con la proteína:
1. Análisis del gen de la seril t-RNA sintetasa:
a) Diseño de primers para la amplificación del gen por PCR.
b) Diseño de primers para amplificar un fragmento interno del gen.
2. Análisis de la proteína seril t_RNA sintetasa:
a) Diseño de primers para amplificar el gen de la proteína con colas de histidina para su rápida purificación.
b) Diseño de primers para la delección de un fragmento del gen de la proteína.
c) Diseño de primers para la mutación de un nucleótido.
d) Diseño de primers para realizar la fusión génica entre la seril t-RNA sintetasa y la proteína fluorescente verde para estudiar su localización celular o su concentración a lo largo del crecimiento del microorganismo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tenemos que realizar distintas PCR para analizar el gen, para ello usamos el plásmido pOJ260 de E.coli (figura 2), en el cual clonaremos el gen de la seril t-RNA sintetasa.
Este plásmido es un plásmido suicida, es decir, no replica en E.coli porque lleva el origen de replicación de otra cepa pero sí puede integrarse en el cromosoma de E. coli por recombinación.
Para poder clonar el DNA del gen en el plásmido tenemos que poner sitios de corte para algún enzima de restricción en los extremos 5´ de los primers, estos sitios de corte tienen que ser para enzimas de restricción que se encuentren dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido.
El plásmido lo introduciremos en células de E.coli para obtener los productos génicos de nuestro gen.
TÉCNICA PCR:
Es la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
Esta técnica es usada para la amplificación de un fragmento de DNA.
Para ello necesitamos buffer de amplificación, primers, desoxinucleótidos trifosfato, Taq polimerasa, DNA molde y adyuvantes.
La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos, cada uno de los cuales incluye tres pasos:
Todo este proceso se realiza en un termociclador al cual le añadimos la mezcla de reacción y el DNA a amplificar.
Usamos dos primers para realizar la amplificación, directo (complementario al extremo 3´ de la cadena codificante) y reverso (complementario al extremo 3´ de la cadena complementaria).
En el extremo 5´ de los primers debemos añadir la secuencia de corte para un enzima de restricción que se encuentre en el polilinker del plásmido para poder clonar este gen en el plásmido.
ESTUDIO DEL GEN Y LA PROTEÍNA:
- Análisis del gen de la seril t-RNA sintetasa:
a) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN POR PCR:Para ello realizamos una técnica de PCR en la cual utilizaremos dos primers flanqueantes al gen , directo y reverso.
En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima BamHI. (ANEXO I).
b) DISEÑO DE PRIMERS PARA AMPLIFICAR UN FRAGMENTO INTERNO DEL GEN:
Para realizar esta amplificación por PCR necesitamos diseñar primers internos al gen, para ello usamos el programa PRIMER 3, el cual nos da varios pares de primers con la probabilidad de cada uno de que sea el correcto, entre ellos elegimos una pareja.
En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima XbaI. (ANEXO II).
a) DISEÑO DE PRIMERS PARA AMPLIFICAR EL GEN DE LA PROTEÍNA CON COLAS DE HISTIDINA PARA SU RÁPIDA PURIFICACIÓN:
Para ello hacemos una PCR utilizando dos primers flanqueantes al gen , directo y reverso.
En el extremo 5´ del primer reverso añadimos 10-12 tripletes para el aminoácido histidina (codón histidina para Rhodococcus TAC)y a continuación el sitio de corte para el enzima de restricción.
En el extremo 5´ del primer directo añadimos la secuencia de corte el enzima de restricción.
En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima BamHI.
Una vez amplificada la proteína la purificamos en una columna de afinidad de Níquel que es muy específica para los residuos de histidina. Al pasar la preparación con la proteína unida a las colas de histidina quedará fuertemente unida a la columna. Posteriormente eluimos la proteína con imidazol para separarla de la columna, obtenemos la proteína unida a la cola de histidinas, a continuación añadimos una enzima (ej: enterocinasa) para eliminar la cola de histidina y así obtener la proteína pura.
(ANEXO III)
b) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA DELECCIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE LA PROTEÍNA:
Deleccionamos un fragmento interno del gen.
Para ello hacemos una PCR usando cuatro primers, dos de ellos externos, igual a los usados en la amplificación del gen, y dos internos. Los internos deben flanquear al fragmento de DNA que queremos deleccionar.
La secuencia de corte para el enzima de restricción debemos añadirla en los extremos 5´ de los primers externos, en este caso usamos la enzima SacII.
(ANEXO IV).
c) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA MUTACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO:
Realizamos la mutación de un nucleótido interno del gen.
Para ello debemos hacer una PCR usando cuatro primers, dos de ellos externos y dos internos.
Los primers externos se diseñan igual que para realizar la amplificación del gen. Los internos son complementarios entre sí, deben de llevar la misma secuencia que el gen y un nucleótido, el que queremos mutar, cambiado por el nuevo que queremos introducir.
Al cambiar el nucleótido podemos cambiar el aminoácido para el que codifica, en este caso cambiamos el aminoácido glicina por valina, para ello mutamos el triplete GGC a GTC.
El nucleótido que queremos mutar debe estar aproximadamente en el centro del primer.
La secuencia de corte para el enzima de restricción debemos añadirla en los extremos 5´ de los primers externos, en este caso usamos la enzima BamHI. (ANEXO V).
d) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA FUSIÓN GÉNICA ENTRE LA SERIL T-RNA SINTETASA Y LA PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE:
Fusionamos el extremos carboxilo de nuestra proteína (Seril t-RNA sintetasa) al extremo amino de la proteína fluorescente verde (GFP).
Para realizar la fusión hacemos una PCR usando también cuatro primers, dos para cada proteína.
El primer 1 debe ser complementario al extremo 3´ de la cadena codificante de la seril t-RNA sintetasa.
El primer 2 debe contener el extremo 5´ de la cadena codificante de la seril t-RNA sintetasa sin el últimos codón (codón STOP) y el extremo 3´ de la cadena codificante de la GFP.
El primer 3 debe contener el extremo 3´ de la cadena complementaria de la seril t-RNA sintetasa eliminando el codón STOP y el extremo 5´ de la cadena complementaria de la GFP.
El primer 4 debe contener el extremo 5´ de la cadena codificante de la GFP.
Los sitios de corte para el enzima de restricción debemos añadirlos en los extremos 5´ de los primers 1 y 4, en este caso usamos la enzima EcoRI.
(ANEXO VI).
PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP):
La GFP se usa para fusionarla con la proteína que queremos estudiar y mediante la emisión de fluorescencia de la GFP poder localizar nuestra proteína.
Esta proteína GFP fue aislada de la medusa Aequorea victoria. Emite luz verde cuando se la ilumina con luz UV gracias al cromóforo que posee que es una estructura de tripéptido cíclico en la secuencia primaria de la proteína, los 3 aminoácidos que forman el cromóforo son Ser65-Tyr66-Gly67. Es una proteína estable que contiene 238 aminoácidos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Esta enzima es un homodímero funcional con un dominio C-terminal característico de la clase II de las aminoacil t-RNA sintetasas y un dominio N-terminal implicado en la unión de los t-RNA (tabla 1).
Pertenece a las llamadas proteínas coiled-coil (gráfico 1), esto es, que tienen dominios para unirse unas proteínas a otras polimerizándose. Esta característica es importante para la estabilidad de la enzima.
Las características fisico-químicas se muestran en la tabla (tabla 2).
Muestra diversos sitios de corte para distintas proteasas, en la tabla se muestran las proteasas que cortan, el número de cortes para cada una de ellas y el sitio específico de corte(tabla 3).
La proteína no presenta péptido líder (gráfico 2), lo cual nos indica que es una proteína citoplasmática, ya que el péptido líder en una proteína es una secuencia de aminoácidos presente en su extremo amino que sirve de señal para excretar la proteína al exterior de la célula.
Es una proteína citosólica, ya que según se muestra en la gráfica (gráfico 3) vemos que la probabilidad de poseer dominios transmembrana es menor que la probabilidad de que esté fuera de la membrana.
Los aminoácidos conservados que presenta la seril t-RNA de Rhodococcus respecto a otros organismos los vemos en la tabla 4.
El árbol filogenético de Rhodococcus se muestra en el gráfico 4.
En cuanto a los resultados obtenidos mediante las PCR:
Tras la delección del fragmento interno del gen vemos que la proteína no es funcional, las proteínas sintetizadas a partir de la seril t-RNA sintetasa deleccionada no se traducen correctamente debido a que no incluyen el aminoácido serina, debido a esto, las bacterias que contienen la enzima deleccionada mueren.
Por el contrario cuando sólo mutamos un aminoácido de la enzima las bacterias sobreviven, la enzima mantiene su funcionalidad aunque su estructura tridimensional es ligeramente distinta a la de la enzima silvestre.
Con el experimento de fusión con la GFP podemos ver la localización de nuestra enzima iluminando las bacterias con luz UV, en este caso vemos una distribución más o menos homogénea de la proteína a través del citoplasma.
El gen posee sitios de corte para varias enzimas de restricción que se muestran en el gráfico 5.
TABLAS Y GRÁFICOS
figura 1
figura 2
tabla 1
gráfico 1
||
Molecular weight: 46955.9
Amino acid composition:
Ala (A) 51 11.9%
Atomic composition:
Formula: C2061H3257N591O637S14
Extinction coefficients:
Ext. coefficient 38640
The N-terminal of the sequence considered is A (Ala).
The instability index (II) is computed to be 31.80
Grand average of hydropathicity (GRAVY): -0.336
541 CAGCTCGGCATGCTGCAGCTGGCGGCGCAGAAGGCGATGGCCAACGGATTCACCATGATG
601 ATCCCGCCGGTGCTGGTGCGCCCCGAGGTCATGCAGGGCACCGGCTTCCTCGGCCAGCAC
661 TCGGACGAGGTCTACCACCTGGCCGACGACGACCTGTACCTCGTCGGCACCTCCGAGGTC
721 CCGCTCGCCGGTTACCACTCGGGCGAGATCCTCGACCTGTCGAACGGCCCCAAGCGGTAC
781 GCGGGCTGGTCGTCGTGCTTCCGCCGCGAGGCCGGCAGCTACGGCAAGGACACGCGCGGC
841 ATCATCCGCGTCCACCAGTTCGACAAGGTGGAGATGTTCACCTACTGCAAGCCGGAGGAC
[[code]] <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;"><<<<<<<<<<<<<<<<<<<<</span>901 GCCGACGCCGAGCATCAGCGCCTGCTCGCGTGGGAGCGCGACATGCTCGACGCGATGGGG
961 CTTCCGTACCGCGTCATCGACGTCGCCGGTGGCGACCTCGGATCGTCCGCGGCCCGCAAG
1021 TTCGACTGCGAGGCTTGGGTTCCCACGCAGCAGGCCTACCGCGAGCTGACGTCGACGTCG
1081 AACTGCACCACCTACCAGGCGCGCCGCCTGAGCGTGCGGTACCGCGACGAGAACGGCAAG
1141 CCGCAGACCGCGGCAACCCTCAACGGCACCCTCGCCACCACCCGCTGGCTCGTTGCGATC
1201 CTCGAAAACCACCAGCAGGCAGACGGTTCCGTGCGTGTCCCGGCTGCACTCGTGCCCTTC
1261 GTCGGGCGTGAGGTGCTGACGGCGCCGTAG
PRIMER DIRECTO: 5´ GCTCTAGATCGCGGTTCTACTTCCTCAC 3´
PRIMER REVERSO: 5´ GCTCTAGATGAACATCTCCACCTTGTCG 3´
PUNTO CORTE XbaI: 5´ GCTCTAGAGC 3´
PRIMER 1: 5´CGCGGATCCGCGCGGCGTAACCAAGTAGG 3´
PRIMER 2: 5´CATGCAGGGCACCGTCTTCCTCGGCC 3´
PRIMER 3: 5´GGCCGAGGAAGACGGTGCCCTGCATG 3´
PRIMER 4: 5´ CGCGGATCCCTACGGCGCCGTCAGCACC 3´
>gfp
5´ ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGT 60
3´ TACTCATTTCCTCTTCTTGAAAAGTGACCTCAACAGGGTTAAGAACAACTTAATCTACCA 60
GATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGA 120
CTACAATTACCCGTGTTTAAAAGACAGTCACCTCTCCCACTTCCACTACGTTGTATGCCT 120
AAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTT 180
TTTGAATGGGAATTTAAATAAACGTGATGACCTTTTGATGGACAAGGTACCGGTTGTGAA 180
GTCACTACTTTCGGTTATGGTGTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAG 240
CAGTGATGAAAGCCAATACCACAAGTTACGAAACGCTCTATGGGTCTAGTATACTTTGTC 240
CATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCTGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTC 300
GTACTGAAAAAGTTCTCACGGTACGGACTTCCAATACATGTCCTTTCTTGATATAAAAAG 300
AAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTT 360
TTTCTACTGCCCTTGATGTTCTGTGCACGACTTCAGTTCAAACTTCCACTATGGGAACAA 360
AATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAA 420
TTATCTTAGCTCAATTTTCCATAACTAAAATTTCTTCTACCTTTGTAAGAACCTGTGTTT 420
TTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGA 480
AACCTTATGTTGATATTGAGTGTGTTACATATGTAGTACCGTCTGTTTGTTTTCTTACCT 480
ATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGAC 540
TAGTTTCAATTGAAGTTTTAATCTGTGTTGTAACTTCTACCTTCGCAAGTTGATCGTCTG 540
CATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTAC 600
GTAATAGTTGTTTTATGAGGTTAACCGCTACCGGGACAGGAAAATGGTCTGTTGGTAATG 600
CTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTT 660
GACAGGTGTGTTAGACGGGAAAGCTTTCTAGGGTTGCTTTTCTCTCTGGTGTACCAGGAA 660
CTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAA 3´ 717
GAACTCAAACATTGTCGACGACCCTAATGTGTACCGTACCTACTTGATATGTTTATT 5´ 717
PRIMER 1: 5´CCGGAATTCGCGCGGCGTAACCAAGTAG3´
PRIMER 2: 5´CTTCTCCTTTACTCATCGGCGCCGTCAGCACC3´
PRIMER 3: 5´GGTGCTGACGGCGCCGATGAGTAAAGGAGAAG3´
PRIMER 4: 5´CCGGAATTCTTATTTGTATAGTTCATCC3´
SITIO CORTE EcoRI: 5´CCGGAATTCCGG 3´
BIBLIOGRAFIA